Teste SARS-CoV-2 (COVID-19) RealPCR da IDEXX

Estudos de validação de metodologia analítica e especificidade cruzada

Os Laboratórios de Referência IDEXX desenvolveram um novo teste de PCR em tempo real para detectar o SARS-CoV-2 (COVID-19), com base em um alinhamento exclusivo com as sequências genéticas do vírus publicadas a partir da pandemia humana. O teste SARS-CoV-2 (COVID-19) RealPCR da IDEXX atende aos requisitos de validação de metodologia analítica. Os estudos de especificidade não demonstraram reatividade cruzada  do novo teste de PCR em relação aos coronavírus veterinários comuns que afetam animais de companhia. Do mesmo modo, foi comprovado que os testes RealPCR disponíveis atualmente para esses coronavírus veterinários não detectam ácido nucleico sintético de COVID-19. Os testes RealPCR da IDEXX foram concebidos e são realizados em uma plataforma PCR padrão em tempo real no laboratório de diagnóstico molecular (PCR) da cidade de West Sacramento, na Califórnia. Mais de 4.000 amostras de cães, gatos e cavalos foram testadas com o novo teste SARS-CoV-2 (COVID-19) RealPCR da IDEXX. As amostras dos pacientes foram enviadas dos Estados Unidos e da Coreia do Sul ao longo de um período de quatro semanas, com início em 14 de fevereiro de 2020, e incluíram amostras de regiões que atualmente apresentam casos de COVID-19 humana, como a região de Seattle nos EUA. As amostras também foram testadas em paralelo com três ensaios dos Centros de Controle de Prevenção de Doenças (Centers of Disease Control and Prevention, CDC). Até o momento, não foram detectados resultados positivos em nenhuma amostra. Nosso monitoramento de amostras de caninos e felinos encaminhadas para o Painel Respiratório RealPCRTM continua em andamento e foi expandido para Canada, todo Estados Unidos, e países da União Européia, incluindo áreas com alta taxa de COVID-19 na população humana. Todas as amostras testadas foram negativas para COVID-19.

Desenho do ensaio e validação de metodologia analítica

O teste SARS-CoV-2 (COVID-19) RealPCR da IDEXX tem como alvo o mesmo gene do nucleocapsídeo usado nos ensaios do CDC. Esse alvo teve como base a análise sequencial demonstrando elevada conservação e foi adaptado para atender ao ponto de fusão e aos requisitos analíticos da nossa plataforma padronizada. A validação do teste envolveu inicialmente análise do BLAST sequencial em contraste com mais de 300 sequências genéticas disponíveis publicamente. Na segunda etapa, foi utilizado um controle positivo sintético para validar funcionalmente o desempenho do ensaio, o qual atendeu aos requisitos de relação sinal-ruído robusta durante a eficácia da amplificação, reprodutibilidade intracorrida e intercorrida, e correlação. Além disso, a IDEXX implementou três ensaios do CDC para serem executados em paralelo com o ensaio da IDEXX para fins de confirmação. Os três ensaios confirmatórios foram adotados do CDC, publicados originalmente em 24 de janeiro de 2020.1,2

A especificidade cruzada dos quatro ensaios (SARS-COV-2) foi confirmada com o uso de alvos de coronavírus veterinário sintético positivo e amostras com PCR positivo para coronavírus respiratório canino, coronavírus entérico canino e felino, e coronavírus entérico equino encaminhadas por meio da oferta de diagnóstico da IDEXX. Os controles a seguir foram executados durante a fase de validação do PCR em tempo real e triagem: 

  • Controle negativo para a extração (negative extraction control, NEC): todos os controles negativos para a extração apresentaram resultado negativo segundo o PCR.
  • Controle de qualidade pré-analítico das amostras usando um ensaio PCR TaqMan® em tempo real para um gene de controle endógeno. Todas as amostras, independentemente de seu caráter positivo ou negativo, passaram no controle de qualidade.
  • Controles negativos do PCR: todos os controles PCR-negativos apresentaram resultado negativo.
  • Controles positivos do PCR: todos os controles PCR-positivos (controles sintéticos positivos) apresentaram resultado positivo.
  • Monitoramento da contaminação ambiental: todas as amostras de locais diferentes no laboratório de PCR apresentaram resultado negativo no monitoramento da contaminação.

As amostras com PCR positivo de coronavírus respiratório canino, coronavírus entérico canino e felino, e coronavírus entérico equino que foram encaminhadas por meio da oferta de diagnóstico da IDEXX também foram rastreadas em relação a todos os ensaios do SARS-CoV-2. Todos os ensaios do CDC e ensaios SARS-CoV-2 (COVID-19) RealPCR da IDEXX apresentaram resultados negativos nessa população para outros coronavírus.

Metodologia de triagem

Foram utilizadas amostras selecionadas aleatoriamente a partir das amostras encaminhadas por meio da oferta de diagnóstico da IDEXX RealPCR para problemas respiratórios caninos, problemas respiratórios felinos, problemas respiratórios equinos, diarreia felina, diarreia canina e diarreia equina. As amostras utilizadas inicialmente para triagem consistiram de swabs (a maioria swabs faríngeos profundos [garganta] e conjuntivais [ocular]) e fezes. Entre as mais de 3.500 amostras analisadas de 14 de fevereiro a 12 de março:

  • As amostras analisadas vieram de todos os 50 estados e da Coreia do Sul.
  • 55% das amostras eram de caninos, 41% de felinos, 4% de equinos.
  • 77% eram respiratórias, 23% eram fecais.

 

Referências

  1. Centers for Disease Control and Prevention, Division of Viral Diseases. CDC 2019-Novel Coronavirus (2019-nCoV) Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel Instructions for Use. Publicação do CDC CDC-006-00019, Revisão: 02. www.fda.gov/media/134922/download. Em vigor a partir de 15 de março de 2020. Consultado em 16 de março de 2020.
  2.  Centers for Disease Control and Prevention, Division of Viral Diseases. Research Use Only Real-Time RT-PCR Protocol for Identification of 2019-nCoV. www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/rt-pcr-detection-instructions.html. Atualizado em 14 de março de 2020. Consultado em 16 de março de 2020.

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